(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)
茶葉是我國(guó)豐富的天然植物資源，富含具有保健藥效功能的茶多酚(Tea Polyphenols，TP)?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明茶多酚是一類新型的天然、高效、安全的食品抗氧保鮮劑。茶多酚易溶于水、甲醇、乙醇、丙醇及乙酸乙酯，不溶于氯仿、苯等有機(jī)溶劑，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗氧化、防癌、抗腫瘤、抗輻射、抑菌、抗病毒、降血糖和血脂、預(yù)防心血管疾病、抗衰老等多種天然生物活性。目前茶葉中茶多酚的提取多采用溶劑提取法、金屬離子沉淀法、超聲波浸提法、樹脂吸附法等。超臨界萃取法工藝過程簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，所采用的溶劑為二氧化碳，無(wú)毒無(wú)污染。
本文探討了以超臨界二氧化碳萃取技術(shù)提取綠茶中茶多酚，優(yōu)化了提取條件。本研究旨在開發(fā)一種新的保鮮方法，即通過對(duì)比和分析不同濃度茶多酚和特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)溶液浸泡過蝦后的pH值變化，及揮發(fā)性鹽基氮值的變化，對(duì)茶多酚在南美白對(duì)蝦的保鮮效果進(jìn)行分析研究。
1 材料與方法
1．1 主要儀器與試劑
紫外可見分光光度計(jì)；高效液相色譜儀；Delta 320-s型pH計(jì)(梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司)；KJELTEC(TM)2300凱氏定氮儀(瑞典福斯公司)；超臨界二氧化碳萃取儀(美國(guó)Foss公司)。
99%特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)；氧化鎂；八種兒茶素和咖啡堿標(biāo)樣；乙醇，乙酸乙酯，無(wú)水硫酸鈉。試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。
綠茶下腳料。試驗(yàn)所用南美白對(duì)蝦購(gòu)于上海曹安水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。
1．2 超臨界二氧化碳萃取茶多酚流程
干茶葉—一稱取14 g—一放入萃取釜——加熱至所需溫度——打開進(jìn)氣閥——啟動(dòng)高壓泵——調(diào)節(jié)壓力至所需值——靜態(tài)萃取——?jiǎng)討B(tài)萃取同時(shí)收集萃取物——取下收集瓶——旋松高壓泵——關(guān)閉氣體閥門——開放氣閥——取下萃取釜——關(guān)閉機(jī)器。
1．3 茶多酚總量的測(cè)定及兒茶素類的分析
按GB/T8313—2002測(cè)定茶多酚總量；茶多酚制品中兒茶素類含量用高效液相色譜法進(jìn)行分析。
1．4 揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定
揮發(fā)性鹽基氮值用凱氏定氮儀測(cè)定。按GB2741—94規(guī)定，海蝦的TVBN(mgN/100g)≤25為一級(jí)鮮度；≤30為二級(jí)鮮度。稱取2 g左右樣品，剪碎，放人蒸餾管中，加入0.5g氧化鎂固體，迅速放進(jìn)自動(dòng)定氮儀蒸餾器上，關(guān)上安全門，儀器自動(dòng)蒸餾、吸收、滴定、計(jì)算。同時(shí)添加同樣氧化鎂做空白試驗(yàn)。
1．5 pH值的測(cè)定
稱取混勻試樣5g，在燒杯中加入50mL蒸餾水，攪拌均勻，放置30 min(不斷振搖)，然后過濾。濾液用酸度計(jì)測(cè)定，直接讀取pH值。
2 結(jié)果與分析
2．1 超臨界二氧化碳萃取茶多酚條件優(yōu)化
2．1．1 壓力對(duì)萃取率的影響 萃取的壓力是超臨界二氧化碳萃取過程中最重要的參數(shù)。萃取溫度一定時(shí)，壓力增大，液體的密度增大，在臨界壓力附近，壓力的微小變化會(huì)引起密度的急劇改變，而密度的增加將引起溶解度的提高。茶多酚為強(qiáng)極性物質(zhì)，但是由于本試驗(yàn)有乙醇作夾帶劑。故在25～40 MPa壓力范圍考察壓力對(duì)萃取率的影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)選定萃取壓力為35 MPa。
2．1．2 溫度對(duì)萃取率的影響 一方面，溫度升高，超臨界流體密度降低，其溶解能力相應(yīng)下降；另一方面，溫度升高使被萃取溶質(zhì)的揮發(fā)性增加，這樣就增加了被萃取物在超臨界氣相中的濃度。當(dāng)然萃取溫度對(duì)溶解度的影響還與壓力有密切的關(guān)系：在壓力相對(duì)較低時(shí)，溫度升高溶解度降低；而在壓力相對(duì)較高時(shí)，溫度升高二氧化碳的溶解能力提高。最后選擇50℃為萃取最佳溫度。
2．1．3 時(shí)間對(duì)萃取率的影響 茶多酚的萃取率隨著靜態(tài)萃取時(shí)間的增加而增加，時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)物的量越大。但是到達(dá)60min以后，茶多酚的萃取率反而隨著時(shí)間而下降，提取的效率就降低，能量和二氧化碳的消耗增加，最適宜的靜態(tài)萃取時(shí)間應(yīng)小于60min。
2．1．4 其它條件對(duì)萃取率的影響 實(shí)驗(yàn)顯示，純乙醇作為夾帶劑直接萃取茶多酚的效果并不比乙醇水溶液好，這與采用純乙醇直接萃取茶多酚的效果不如乙醇水溶液是一致的。同樣可以看出，65% 的乙醇水溶液作為夾帶劑萃取茶多酚的效果為最佳。另外本試驗(yàn)中采用動(dòng)態(tài)萃取過程中動(dòng)態(tài)在線加入夾帶劑，對(duì)茶多酚的萃取率也有很大程度的提高。夾帶劑的用量影響萃取率。隨著夾帶劑量的提高，到一定程度時(shí)，茶多酚的萃取率反而下降。由試驗(yàn)得知，夾帶劑的量(體積mL)：茶葉量(g)為40％時(shí)為最佳條件。
實(shí)驗(yàn)還表明，接收劑的不同對(duì)茶多酚的萃取率也有影響。65%乙醇溫水浴和乙酸乙脂接收都沒有直接用65%乙醇接收萃取率高，可能是因?yàn)闇厮∫欢ǔ潭壬蠈?dǎo)致了茶多酚的氧化，而乙酸乙脂由于其易揮發(fā)的特性，可能會(huì)帶走一部分的茶多酚。試驗(yàn)表明采用65％乙醇接收茶多酚的效果最好。
出口溫度對(duì)萃取率的影響很小，因此，試驗(yàn)中考慮到二氧化碳在不結(jié)冰的情況下，選擇出口溫度為85℃。
2．2 條件優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)
為了提高萃取率，設(shè)計(jì)了以萃取溫度、壓力、時(shí)間、夾帶劑濃度、夾帶劑用量做五因素四水平正交實(shí)驗(yàn)，因素、水平設(shè)計(jì)見表1。
由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)可知，各因素對(duì)萃取率影響的顯著性大小為：A萃取溫度>B壓力>E夾帶劑用量>D夾帶劑濃度>C萃取時(shí)間；最佳工藝條件為：A3B2C1Dl，即萃取溫度為50℃，壓力為35MPa，夾帶劑乙醇濃度為65％，萃取時(shí)間為60min，夾帶劑的量為40％。根據(jù)該分析結(jié)果做了三組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示茶多酚的平均得率為10.5% ，產(chǎn)品兒茶素含量可達(dá)77.35%，高于正交實(shí)驗(yàn)的提取率，說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可信。
2．3 茶多酚制品純化
對(duì)超臨界萃取出的茶湯進(jìn)行簡(jiǎn)單的減壓蒸餾，去除其中的乙醇，然后進(jìn)行冷凍干燥，得到茶多酚制品。樣品HPLC分析結(jié)果見圖1。八種兒茶素和咖啡堿標(biāo)樣見圖2。
從圖1中可以發(fā)現(xiàn)，超臨界萃取茶多酚制品中兒茶素(C)的含量為77.35%。研究表明，茶多酚的生物活性，如抗氧化、抗輻射和抗腫瘤等，主要是由兒茶素在起作用，因此除了關(guān)注茶多酚總量外，更應(yīng)注重兒茶素單體的含量。
2．4 茶多酚的應(yīng)用研究
本文還通過對(duì)市場(chǎng)購(gòu)得的鮮活的南美白對(duì)蝦，首先去頭、剝殼，然后分別置于配制好的不同濃度的茶多酚和特丁基對(duì)苯二酚溶液中，浸泡半小時(shí)。取出，瀝干，裝在保鮮袋里，保存于0～5℃環(huán)境中。定期測(cè)定其揮發(fā)性鹽基氮值和pH值，作為鮮度指標(biāo)。通過對(duì)比和分析結(jié)果表明：0.4%的特丁基對(duì)苯二酚對(duì)蝦肉的保鮮效果最佳，在此環(huán)境下可儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)10 d的時(shí)間；1.6%的茶多酚對(duì)蝦肉保存時(shí)間可達(dá)8 d。但由于茶多酚為天然抗氧化劑，所以相比較茶多酚是比較理想的保鮮劑。
為考察茶多酚的保鮮效果，同時(shí)試驗(yàn)了不同濃度TBHQ溶液對(duì)南美白對(duì)蝦的保鮮效果，作為對(duì)比。在貯藏過程中，對(duì)照組A在第7 d其TVBN值已經(jīng)達(dá)到了35.64 mgN/100g，超過了二級(jí)鮮度的上限，B組和C組到第8 d達(dá)到25.67mgN/100g和20.47 mgN/100g，還不到二級(jí)鮮度上限。而D組到第9 dTVBN值為22.6 mgN/100g，還不到一級(jí)鮮度上限。E組第10 d為25.12 mgN/100g，尚在二級(jí)鮮度范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)顯示各組pH值升高幅度始終小于對(duì)照A組，其中B組和C組的作用最為明顯。
3 結(jié)論
3．1 通過單因素條件的選擇以及正交試驗(yàn)的優(yōu)化，采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)提取綠茶中茶多酚的最優(yōu)條件為壓力35 MPa、釜溫50℃、靜態(tài)萃取時(shí)間1 h、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間1 h。茶多酚的萃取率為10.5%。
3．2 超臨界萃取出的茶多酚只需簡(jiǎn)單的真空冷凍干燥即可得到中兒茶素的含量可達(dá)77.35% 的茶多酚制品，而且未檢測(cè)出咖啡因。該方法操作簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)單易行，分離效果好，使用成本低，且不需要用到有機(jī)溶劑，符合二十一世紀(jì)綠色化學(xué)的理念。
3．3 在選擇夾帶劑的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)65%的乙醇效果最好，茶多酚的萃取率得到了很大程度的提高。
3．4 超臨界二氧化碳萃取茶多酚，只需進(jìn)行簡(jiǎn)單的后續(xù)處理就可以得到純度較高的茶多酚粉末，進(jìn)行有效的應(yīng)用。
3．5 萃取率的大小不僅取決于與溶解度有關(guān)的溫度、壓力和夾帶劑等熱力學(xué)因素，還取決于與萃取速率有關(guān)的分子擴(kuò)散，流動(dòng)形態(tài)和夾帶劑等動(dòng)力學(xué)因素。本試驗(yàn)研究是在試驗(yàn)室條件下進(jìn)行萃取條件的優(yōu)化，在實(shí)際生產(chǎn)中可能還將受到物料量、反應(yīng)釜的容積等因素影響。
3．6 茶多酚保存條件下，通過揮發(fā)性鹽基氮值和pH值的綜合分析，發(fā)現(xiàn)1.60％的茶多酚對(duì)蝦肉保存時(shí)間可達(dá)8 d。起到了延長(zhǎng)南美白對(duì)蝦保鮮期的效果。此外，茶多酚為天然抗氧化劑，對(duì)人體不僅無(wú)毒，還有一定的保健功能。