石陸娥1,2 應國清2 唐振興1 易其喻2 熊文說
（1. 浙江工業(yè)大學化學工程與材料學院；2.浙江工業(yè)大學藥學院：杭州 310014）
在超臨界條件下，溫度和壓力的改變可以影響流體的密度，因此諸如一些由密度決定的常數(shù)如介電常數(shù)，溶解度等就能很好地控制。對于工業(yè)生產(chǎn)可以使生物催化反應和產(chǎn)物的分離同時進行，實現(xiàn)偶聯(lián)操作，在許多的情況下，酶催化反應在有機溶劑中因為反應太慢而不能應用于工業(yè)化大生產(chǎn)。但是在超臨界流體中，由于它很小的傳質(zhì)阻力，使得反應能很快進行，而且有機溶劑在超臨界流體（SCF）中的溶解能力很好；同時它的下游處理和溶劑回收也更加方便。對手性化合物合成和外消旋體拆分的則是良好反應體系。
正是這些優(yōu)點，使得超臨界流體技術(shù)在酶催化反應等領域得到了廣泛應用。在酶催化反應中，目前研究的較多的流體有乙烷、乙烯、三氯甲烷、六氟化硫和CO2等，其中CO2是應用的最廣泛的流體，CO2安全、無毒，它的臨界溫度為31.1℃，接近室溫，可以使熱源性物質(zhì)不會因為溫度的關(guān)系而變性或失活；而且臨界壓力為7.4MPa，適宜工業(yè)化大生產(chǎn)。
1 影響因素
1.1 介質(zhì)水含量
實驗表明，超臨界條件下的酶催化反應體系中固相（酶及載體）必須含有水，哪怕只是薄薄的一層水分子覆在酶表面，水的存在是為了維持酶的活性及其構(gòu)象。Randolph對于膽固醇氧化酶中的水含量研究發(fā)現(xiàn)，如果系統(tǒng)中沒有水的話，酶活將只有有水時候的10％，然而一旦加入1％（體積分數(shù)）的水進入系統(tǒng)后，膽固醇氧化酶的活力又恢復了。
如果加入了比較多的水，正如R Goddard等人報道，在超臨界CO2中油酸和乙醇的酯化反應中，當水含量達到15％（質(zhì)量分數(shù)）時，酶活力最高，繼續(xù)加水則酶活力下降，他們解釋為過多的水在酶附近會形成親水性障礙層使得酶活力降低。到底多少的系統(tǒng)含水量才最合適呢？Condoret等人認為在SC CO2中脂肪酶催化反應的最佳水含量為8％~12％（質(zhì)量分數(shù)）。主要有4個因素影響最佳水含量。
（1）所用流體的極性。Domont報道在SC CO2和乙烷中脂肪酶催化十四烷和乙醇的反應,在CO2中最合適水量比在乙烷要大幾十倍。他認為這是由于CO2的親水性比乙烷強。同樣Kamat等人實驗表明，親水性的溶劑趨向于將水從酶和載體中拉到溶劑中，所以在酶催化反應中，最大的酶活往往是在疏水性溶劑中達到的。
（2）酶的載體。Condoret等人研究了水在超臨界CO2和不同的載體的分配關(guān)系，結(jié)果表明，由于實驗環(huán)境對其平衡有很大的影響，所以不能很精確地估計流體中有多少水含量，載體有多少水。Bosley等人也認為載體與酶表面的結(jié)合水有關(guān)系，并且指出在相同的水含量下，酶在親水性載體表現(xiàn)出較小的活性。這與Kamat的觀點類似。
（3）酶催化反應類型。在酯化反應中，水是生成物，而在水解反應中水卻是反應物被消耗。因此在不同類型反應中最佳水含量是肯定不同的，學者們的實驗也證實了這個觀點。Dumont報道在超臨界乙醇中十四烷酸的反應（12.5MPa，323K）中，只有系統(tǒng)中含水量很大時，才會達到最大的反應速率；Miller等人研究了在超臨界CO2中十四烷酸同甘油三月桂酸酯的反應（9.5MPa，308K），他們認為只有當系統(tǒng)的含水量很低的時候才有較高的酶活。Srivastava等人也持同樣的觀點，他們在超臨界CO2進行了肉豆蔻酸的酯交換反應，發(fā)現(xiàn)水的添加會導致肉豆蔻酸的酯化率呈指數(shù)級的下降（圖1）；他們?yōu)榇藢O2氣體通過硅土床，從而使得含水量減少，酯化率也從19％上升到22％。
（4）水的添加方式。Steytler在SC CO2下（30MPa，40℃），用Candida脂肪酶催化丁酸和月桂酸的合成，發(fā)現(xiàn)在反應器填充完全后再加水到催化劑床層上，酶活將會比較高；如果是直接將水加入到容器中和酶充分接觸，那么酶活會很低。
另外有學者認為系統(tǒng)含水量對于最初反應速率及酶活和穩(wěn)定性有一定的關(guān)系Nakamura在超臨界CO2和n-hexane中,發(fā)現(xiàn)當水含量不足1％（質(zhì)量分數(shù)）時，最初反應速率并沒有因為流體的不同而有差異，但是系統(tǒng)中的含水量超過了20％（質(zhì)量分數(shù)）后，在CO2的最初反應速率要比在n-hexane中大4倍。Ma人ty對于固定化酶的研究發(fā)現(xiàn)，如果系統(tǒng)中含有水，那么酶的穩(wěn)定性將會下降。但是也有學者有相反的觀點。Sovova等人在SC CO2中黑醋栗油的酶催水解反應發(fā)現(xiàn)，CO2中的水含量對于反應速率幾乎沒有影響。
1.2 溫度和壓力
如前所述，溫度和壓力的微小改變會導致流體的密度大幅度的改變，從而改變流體的物理性質(zhì)及反應機制，但對于酶活及酶本身的選擇性和穩(wěn)定性也都有影響，在臨界點附近這種影響更加明顯。Matsuda等人在SC CO2中通過改變溫度和壓力從而改變3-氟甲基對氯苯基甲醇的立體選擇性的酶催化反應，這個結(jié)果符合Eyring 關(guān)于溫度對于物質(zhì)的立體化學結(jié)構(gòu)影響的理論。Srivastava研究了溫度從30℃到75℃對于該催化反應的影響。他們實驗結(jié)果表明，酯化率由35℃時的12％上升到45℃的19％，但是隨著溫度的持續(xù)上升，酯化率卻下降，直到70℃的3％。他認為這不是酶失活的原因，因為同是這個酶在超臨界CO2下十二酸酯的水解反應中，在,65℃下有最高的水解率，在超臨界CO2下酶的穩(wěn)定性還是很好的。kamat等人證實了壓力對于超臨界三氟甲烷流體的物理性質(zhì)的影響，即每當增加13.8MPa就會導致4％的三氟甲烷的介電常數(shù)的提高。Eyring等人認為壓力對于反應機制也是個影響因素，并且他們還提出了Eyring形態(tài)轉(zhuǎn)變理論，用來解釋壓力對于反應速率的影響。Oliveira在SC CO2流體下用脂肪酶催化棕櫚油的反應表明，最初反應速率（％/min，丙三醇質(zhì)量分數(shù)） 從6MPa的13.09％提高到9MPa的28.15；但是繼續(xù)增加壓力，反應速率急劇下降，在20MPa時只有6.66。他認為在SCF中的酶催化反應的最大反應速率應該在流體的臨界點附近。
Chaudhary等人指出隨著超臨界三氟甲烷的壓力的改變，枯草桿菌蛋白酶的活力和選擇性也會大幅度的變化，原因是壓力的變化改變了溶劑的物理性質(zhì)，而酶的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。Randolph也有同樣的觀點，通過核磁共振譜圖發(fā)現(xiàn)，在SC CO2流體下，壓力對于膽固醇氧化酶的結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響。
但是也有學者認為正是壓力的改變誘導了酶的結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而導致了酶活的改變。
1.3 底物及產(chǎn)物含量
Srivastava在該實驗中發(fā)現(xiàn)，如果底物（乙醇）用量過多的話將會導致酶的催化能力的弱化。R Goddard也有同樣的觀點，他認為當親水性的底物如乙醇加入的量過多，會改變水在超臨界流體中的分配，使得固定化酶中的水分丟失以至酶活減少。
Endo Yasushi認為在超臨界流體酯交換反應過程中，如果選擇性的把反應產(chǎn)物分離出反應體系中，那么可以提高酯交換率。 陳惠晴在超臨界CO2中用假絲酵母脂肪酶催化月桂酸和正丁醇反應，她發(fā)現(xiàn)當正丁醇濃度小于100mmol/L，反應速率隨著濃度的增加而提高，但是正丁醇濃度從100mmol/L增加到400mmol/L， 反應速率下降了60％。
1.4 夾帶劑
有機溶劑在超臨界流體中的溶解能力很好；如果是極性有機物在非極性的流體中反應，那么它的溶解度就很小了，使得反應速度減慢。為此，采取了添加極性夾帶劑（乙醇、水等）的方法。Randolph研究表明乙醇能明顯提高酶催化反應速率。Capewell在3-羥基酯的酶催化反應中添加了丙酮、癸烷等夾帶劑，發(fā)現(xiàn)它們對于反應并沒有太大的影響，只有癸烷能提高對映體過量值（ee）及轉(zhuǎn)化率。在實際的大生產(chǎn)中，夾帶劑的添加將會使得產(chǎn)物的分離變得更加復雜，并且有可能有副產(chǎn)物的生成。因此應根據(jù)實際生產(chǎn)決定合適的夾帶劑。
2 反應機理
超臨界流體的特殊性質(zhì)決定了它的反應機理的復雜性。Kamat認為，甲基丙烯酸甲酯和乙基己醇的反應在所有非水體系的反應機理應該是大致相同的。他認為在超臨界乙烷中該反應可以用米氏方程來表示，并且還符合底物（乙基己醇）抑制的Ping-Pong Bi-Bi機理。他解釋這可能是酶首先和底物生成不可逆的復合物，或者是和甲基丙烯酸甲酯（MMA）生成復合物，這種復合物能和甲醇形成一種酰酶的中間產(chǎn)物，這個中間產(chǎn)物隨后和底物生成二元復合物，使得它能夠分離出產(chǎn)物和游離酶。R Goddard，Marty和Dumont等人也有類似的觀點。其中R Goddard還發(fā)現(xiàn)當?shù)孜铮ㄒ掖迹┑牧繛?50mmol時，表現(xiàn)為競爭性抑制反應，當乙醇的量為300mmol，那么就表現(xiàn)為非競爭性抑制反應了。Marty也建立了在超臨界CO2中油酸和乙醇反應的合適模型。
3 在合成和拆分手性藥物上的應用
手性藥物的制備已經(jīng)成為世界醫(yī)藥領域新的研究熱點，學者們分別采用不同的方法來得到具有生物活性的手性化合物。由于旋光異構(gòu)體之間的物化性質(zhì)太相近，用傳統(tǒng)的合成后再拆分的方法效果不是很好。酶的高度區(qū)域選擇性和立體專一性，決定了在這一領域酶催化反應具有廣闊的應用潛力。
許多文獻報道，在傳統(tǒng)的有機溶劑酶反應就有很好的立體選擇性，所以在超臨界流體下的立體選擇性還沒有更多的闡明。很多的情況下，在超臨界流體中進行手性藥物的合成比在有機溶劑中的效果更好，有的ee值甚至達到了99％。如Mase等人指出，丙二酸二乙酯的酶催化反應如果在己烷等6種不同有機溶劑中進行，那么ee值幾乎為0；而在SC CO2中，ee值可以達到50％，同時轉(zhuǎn)化率也達到了41％。他解釋這是因為酶的活性部位在超臨界條件下隨著壓力的變化發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。根據(jù)這個設想，他推出了這個反應的對映體選擇性可能機制。
Hartmann等人也認為在SC CO2中的立體選擇性要比在己烷中好，他認為在己烷中酶的失活與氨基甲酸鹽有一定的關(guān)系。另外有許多學者就溫度、壓力以及底物濃度等參數(shù)對于對映體選擇性的影響進行了研究。
如表1，在合成和拆分手性化合物的應用方面，學者們的研究主要集中在超臨界CO2和脂肪酶。因此，開發(fā)出新的高效的流體和酶使之更好地應用于實際大生產(chǎn)中將是今后的研究目標。
4 結(jié)束語
超臨界流體作為一種獨特的非水反應介質(zhì)，與有機溶劑比較它有許多的優(yōu)點，它可以替代許多的有機溶劑。目前，大部分工作只停留在實驗研究，而且流體和酶的選擇過于集中。因此，如何使得這項技術(shù)應用于實際的大生產(chǎn)尤其是在手性藥物合成和拆分方面的應用將是今后研究的方向。