摘要:正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了超臨界CO2 萃取香椿葉總黃酮的工藝。在原料50 g,分離室Ⅰ溫度35 ℃、壓力7 MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲(chǔ)罐平衡條件下,超臨界CO2 萃取香椿葉中總黃酮的最佳工藝條件為:萃取壓力30MPa,萃取溫度45 ℃,萃取時(shí)間215 h,夾帶劑用量為3 mL /g原料, CO2 流量35 L /h,提取5次,前2次用無水乙醇、后3次用體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇做夾帶劑。在此條件下1 g香椿葉中提取的總黃酮質(zhì)量為81836 9 mg,總萃取率為51106% ,提取物以總黃酮計(jì)的清除2, 22二苯代苦味?；诫禄?DPPH)自由基的IC50為51080 g?g- 1。
關(guān)鍵詞:香椿葉;總黃酮;超臨界CO2 萃取;夾帶劑;中藥現(xiàn)代化。
香椿Toona sinensis (A. Juss. ) Roem 屬楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)落葉喬木[ 1 ] ,材菜兼用,在我國具有悠久的栽培歷史[ 2 ] ,不但是我國特有速生用材樹種[ 3 ] ,而且被國外稱為“綠色保健菜”[ 4 ] 。研究發(fā)現(xiàn)香椿葉含有黃酮類化合物[ 5 ] 。生物類黃酮具有心血管系統(tǒng)活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗氧化自由基活性,以及抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝等多種生物活性[ 6 ] ,特別是具有抗自由基及抗癌、防癌作用,使生物類黃酮在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣闊的前景。因此,黃酮的提取制備技術(shù)的研究具有重要意義。
超臨界流體萃取( SFE)是利用超臨界流體對(duì)中藥及天然藥物有效成分進(jìn)行提取分離的新型技術(shù),與傳統(tǒng)分離提取方法相比,具有產(chǎn)品純度高、收率高,有效成分破壞少,操作簡單、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn),還可通過控制臨界溫度和壓力的變化達(dá)到選擇性提取和分離純化的目的。超臨界CO2 萃取,已應(yīng)用于提取柿葉黃酮[ 7 ] 、藜蒿黃酮[ [ 8 ] 、甘草黃酮[ 9 ] 、銀杏葉黃酮[ 10 ]等,顯示該技術(shù)有良好應(yīng)用前景。
作者研究了超臨界CO2 提取香椿葉中總黃酮的工藝條件和提取物清除DPPH自由基的能力。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交實(shí)驗(yàn)方案,以總黃酮得率為主考察指標(biāo),提取物以黃酮計(jì)的清除DPPH自由基的IC50值為次考察指標(biāo),對(duì)香椿葉總黃酮的超臨界CO2 單次提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選,結(jié)合提取次數(shù)實(shí)驗(yàn),確定了香椿葉總黃酮的超臨界CO2 提取工藝。 材料與方法
1．1、儀器、試劑與材料
儀器: HA121 - 50 - 01 型超臨界CO2 萃取裝置,江蘇省南通市華安超臨界萃取有限公司; UV /V IS2802PCS型分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司; 7230G可見分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司; SH IMADZU AY120 型電子分析天平,島津國際貿(mào)易(上海)有限公司; ES - 600型電子天平,長沙湘平科技發(fā)展有限公司; pHS - 3C型精密pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠。試劑: 2, 22二苯代苦味?；诫禄?DPPH) , C18H12N5O6 ,相對(duì)分子質(zhì)量394133, Sigma - Aldrich公司;蘆丁,四川光泰制藥有限公司;體積分?jǐn)?shù)95 %乙醇,三氯化鋁,醋酸鈉,冰醋酸均為國產(chǎn)AR;食品級(jí)CO2 ,長沙高科氣體有限公司; 水為自制新鮮蒸餾水。 材料:所用香椿葉于2005年11月下旬采自中南林業(yè)科技大學(xué)株洲校區(qū),由中南林業(yè)科技大學(xué)劉克旺教授鑒定為Toona sinensis (A. Juss. ) Roem. 的葉子。采后沖洗并將葉片與葉軸分開,葉片在烘箱中于50 ℃烘至手可捏碎,粉碎過篩,收集過18目篩不過100目篩部分(過100目篩部分另外收集) ,放置干燥避光處密封保存?zhèn)溆谩?nbsp;實(shí)驗(yàn)
1.2.1、檢測方法
采用分光光度法測定,以黃酮計(jì)的IC50值表示提取物清除DPPH自由基能力[ 11 ] 。IC50值的物理意義為:當(dāng)抗氧化劑清除DPPH自由基達(dá)到50%清除率時(shí),單位質(zhì)量抗氧化劑所清除DPPH的質(zhì)量。采用改進(jìn)的AlCl3 顯色分光光度法測定、計(jì)算超臨界CO2 萃取物中的黃酮質(zhì)量,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作如下:準(zhǔn)確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑01033 5 g,用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶解,并定量轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇定容,搖勻得質(zhì)量濃度為01335 g?L - 1標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、 410 mL于25 mL 容量瓶中,分別加入110 mL 015mol?L - 1三氯化鋁水溶液,搖勻放置15 min,用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇定容至刻度,搖勻,超聲振蕩5 min后,選用1 cm比色皿在410 nm波長處測定其吸光度,參比為空白三氯化鋁水溶液。以吸光度A 對(duì)蘆丁質(zhì)量濃度ρ作圖,得圖1校準(zhǔn)曲線,其回歸方程: A= 0.023 2ρ- 0.023 5, R2 = 0.999 8。線性范圍的蘆丁質(zhì)量濃度為2.68～53.6 mg/L。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程即可計(jì)算出試液的質(zhì)量濃度和提取物中黃酮質(zhì)量。
1.2.2、原料總黃酮含量和含水率的測定
稱取5 g香椿葉2份,分別放入250 mL錐形瓶中,用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作提取劑,第一次和第二次提取的溶劑用量為45 mL,第一次提取時(shí)間為90 min,以后每隔1 h提取一次,提取劑用量以剛好浸沒料渣為宜,直到浸提液經(jīng)顯色反應(yīng)后,其吸光度接近于0為止,參比為空白試劑。合并上述浸提液,采用AlCl3 顯色分光光度法測定提取物中的黃酮量[ 12 ] 。計(jì)算得總黃酮量為171306 5 mg/g香椿葉。黃酮提取率=提取出的黃酮質(zhì)量/香椿葉中總黃酮質(zhì)量。
1.2.3、超臨界萃取
確稱取一定量的原料,裝入料筒放進(jìn)萃取釜,按工藝要求調(diào)節(jié)好萃取溫度、CO2 流量,待制冷系統(tǒng)和萃取溫度、CO2 流量等達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,加入設(shè)定種類和用量的夾帶劑,開動(dòng)高壓泵進(jìn)行循環(huán)萃取操作。從鋼瓶出來的CO2 通過過濾系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)后,經(jīng)高壓泵達(dá)到所需壓力,由預(yù)熱系統(tǒng)升至所需溫度,然后與原料接觸,被萃取成分溶解在CO2 中,萃取物流進(jìn)入分離系統(tǒng),通過改變壓力或溫度,降低其在超臨界CO2 流體中的溶解度而被析出,萃取物用接收瓶接收后取樣分析, CO2 氣體經(jīng)流量計(jì)計(jì)量后返回,再通過過濾系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)循環(huán)利用。
1.2.4、超臨界萃取的正交實(shí)驗(yàn)方法
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,考慮安全性及經(jīng)濟(jì)性,固定無水乙醇為夾帶劑,分離室Ⅰ溫度35 ℃、壓力7MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲(chǔ)罐平衡,再以萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間、夾帶劑用量、CO2 流量為影響因素,采用正交實(shí)驗(yàn)確定各因素不同水平對(duì)萃取結(jié)果及IC50值的影響,選用L16 (45 )正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)。
1.2.5、超臨界萃取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
在正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳萃取工藝條件下,平行作兩次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。同時(shí)在此基礎(chǔ)上作萃取次數(shù)為5次的單因素實(shí)驗(yàn),尋找較佳的提取次數(shù)。
2、結(jié)果與討論
極差分析
對(duì)以上正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果作極差分析,結(jié)果如表2示 由表2可看出,各最佳水平按因素主次順序排列為,黃酮提取量: A3 > E3 >D2 >B2 > C1 ;以總黃酮清除DPPH的IC50值: C4 >D4 > A4 > E4 > B3。分析各因素最佳水平順序,以黃酮提取量為主,提取物以黃酮計(jì)的清除DPPH的IC50值為次參考指標(biāo)綜合考慮,可以得到在本實(shí)驗(yàn)條件下單次提取的最佳工藝:A3B2 C1D2 E3 ,即稱取50 g原料,在分離室Ⅰ溫度35℃、壓力7MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲(chǔ)罐平衡條件下,以3 mL?g- 1加入無水乙醇做夾帶劑,在萃取壓力30MPa、萃取溫度45 ℃、CO2 流量為35 L?h- 1循環(huán)萃取215 h。
3、結(jié)論
(1)超臨界CO2 萃取香椿葉中黃酮類化合物時(shí),單次提取各因素對(duì)黃酮提取量的影響大小次序?yàn)?萃取壓力> CO2 流量>夾帶劑用量>萃取溫度>萃取時(shí)間。萃取壓力對(duì)黃酮提取量影響顯著,但對(duì)提取物以黃酮計(jì)的清除DPPH的IC50值的影響不顯著;萃取溫度、萃取時(shí)間、夾帶劑用量、CO2 流量對(duì)黃酮提取量和提取物以黃酮計(jì)的清除DPPH的IC50值的影響不顯著。
(2)在原料50 g,分離室Ⅰ溫度35 ℃、壓力7MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲(chǔ)罐平衡條件下,超臨界CO2 萃取香椿葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件為:萃取壓力30MPa,萃取溫度45 ℃,萃取時(shí)間215 h,夾帶劑用量為3 mL /g原料, CO2 流量35 L /h,提取5次,前2次用無水乙醇、后3次用體積分?jǐn)?shù)85%的乙醇做夾帶劑。在此條件下香椿葉黃酮提取量為81836 9 mg/g,總萃取率為51106%,提取物以黃酮計(jì)的清除DPPH自由基的IC50為51080 g?g- 1。