(1．宜興市第二人民醫(yī)院藥劑科江蘇宜興214221；2．江蘇弘惠醫(yī)藥有限公司研發(fā)部)
何首烏為蓼科植物(Polygonum multiflorum Thunb．)的塊根，生用能解毒消癰、潤腸通便，制用補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究證明，何首烏主要含二苯乙烯苷、羥基蒽醌類、磷脂、淀粉類成分，具抗衰老、降血脂、抗動(dòng)脈硬化，增強(qiáng)免疫功能等作用，其中二苯乙烯苷是何首烏中特有的生物活性成分，具有抗氧化清除自由基，延緩衰老，增強(qiáng)記憶，降低膽固醇，保肝等多重功能，作為抗衰老的指標(biāo)組分極具研究的價(jià)值。超臨界流體萃取(SFE)是近代分離領(lǐng)域出現(xiàn)的高新技術(shù)，除了可以減少有機(jī)溶劑使用外，還具有萃取效率和選擇性高、省時(shí)、萃取溶媒便于揮發(fā)、提取物較為干凈、環(huán)境污染小、操作條件易于改變等特點(diǎn)，是一種較為理想的萃取方法。本文建立了SFE—HPLC法分離測定何首烏中的有效成分二苯乙烯苷，為何首烏及其制劑的質(zhì)量控制提供方法學(xué)依據(jù)。
1 儀器與試劑
HP1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-5OOB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠)；二苯乙烯苷對(duì)照品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110844-200505)，乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純，何首烏藥材由北京綠野藥材公司提供，由中國藥科大學(xué)李會(huì)軍老師鑒定。
2 方法與結(jié)果
2．1 色譜條件
色譜柱：Symmetry C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙睛-水(20:80)；流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：320nm；柱溫：室溫 。
2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
分別精密吸取濃度為0.10 mg·ml-1的二苯乙烯苷對(duì)照品溶液2，5，10，15，20μl，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，二苯乙烯苷的量(g)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=3.50×1O3X—154，r=0.999 9(n=5)，結(jié)果表明二苯乙烯苷在0.2~2.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2．3 精密度試驗(yàn)
取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次5μl，對(duì)照品峰面積積分值的RSD為1.02％ 。
2．4 回收率試驗(yàn)
取5份已測定含量的同一何首烏樣品液，分別準(zhǔn)確加入二苯乙烯苷對(duì)照品適量，在選定色譜條件下進(jìn)樣并計(jì)算，結(jié)果二苯乙烯苷平均回收率分別為102.4％(RSD為1.73％)。
2．5 萃取物有效成分含量的測定
將萃取物減壓加熱揮去溶劑并定量，加入計(jì)量的稀乙醇，加熱使萃取物溶解，定量，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)樣。采用高效液相色譜儀作定量分析。(對(duì)照品、樣品色譜圖見圖1)。三批樣品測定結(jié)果分別為6.376、6.385、6.369 mg·g-1。
2．6 二苯乙烯苷超臨界CO2萃取條件確定
影響超臨界流體萃取的因素較多，試驗(yàn)表明萃取的溫度、壓力、時(shí)間和改性劑用量的選擇是影響超臨界萃取效果的關(guān)鍵所在，為此本試驗(yàn)選取這4個(gè)主要因素作為考察對(duì)象，以二苯乙烯苷的提取率作為考察目標(biāo)，按照正交設(shè)計(jì)L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)的因素、水平見表1。
具體方法為：取干燥粉碎的何首烏粗粉400 g，裝入萃取釜里，密封。設(shè)定萃取、分離所需溫度、流量，打開萃取器、分離器和系統(tǒng)的其他加熱裝置，進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)熱，啟動(dòng)高壓泵，加人一定量的改性劑。打開CO2進(jìn)氣開關(guān)，啟動(dòng)壓縮機(jī)，使壓力達(dá)到所要求的范圍，保持一定的時(shí)間，打開分離釜I、分離釜Ⅱ，進(jìn)行分離操作，分別收集萃取分離的生首烏有效成分。含量測定結(jié)果表見表2，方差分析表見表3。
以何首烏中有效成分二苯乙烯苷的得率為考察指標(biāo)，由統(tǒng)計(jì)軟件的分析結(jié)果可以看出，各因素作用的顯著性次序依次為：A>B>D>C，在正交表選擇的各因素中，萃取壓力對(duì)有效成分的影響最大，同時(shí)萃取溫度對(duì)二苯乙烯苷的收率也有顯著性影響。萃取時(shí)間對(duì)收率影響不顯著，可作為方差分析的誤差項(xiàng)。根據(jù)方差分析結(jié)果，可得最佳工藝條件為A3B3C2D1，即萃取壓力40 MPa，萃取溫度60℃ ，萃取時(shí)間2h，夾帶劑95％乙醇量為生藥的20％ 。在此最佳工藝中，提取物干膏中二苯乙烯苷含量可達(dá)6.387％ ，提取轉(zhuǎn)移率為79.45％。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：取干燥粉碎的何首烏粗粉400 g，按正交試驗(yàn)所得最佳工藝(萃取壓力40 MPa，萃取溫度60℃ ，萃取時(shí)間2 h，夾帶劑95％ 乙醇量為生藥的20％)提取藥材中二苯乙烯苷，所得萃取物干燥后采用高效液相色譜法色譜法測定，結(jié)果二苯乙烯苷純度為6.192 mg·g-1，說明該最佳工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。
3 討論
應(yīng)用超臨界萃取法是當(dāng)前中草藥有效成分提取方法的發(fā)展方向，超臨界CO2萃取技術(shù)以其萃取效率高、純度好、節(jié)約能耗、生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，在中醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。何首烏中二苯乙烯苷見光易分解，在高溫、強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定，而采用超臨界萃取法提取二苯乙烯苷可避免以上問題。
何首烏藥材粒度大小對(duì)萃取效果有一定的影響，超臨界流體萃取的過程存在一個(gè)溶解速率和溶解度的問題，粒度大，溶解速率相對(duì)較慢，粒度小，溶解速率相對(duì)較快。通過預(yù)試，對(duì)不同粉碎度的何首烏中二苯乙烯苷的含量測定，發(fā)現(xiàn)粉碎度較大的何首烏中二苯乙烯苷的含量較高，而未粉碎的何首烏含量較低。這提示，要保證制劑質(zhì)量，選擇適當(dāng)粉碎度的藥材是必要的。
在萃取苷類成分時(shí)，夾帶劑的選擇和用量是比較關(guān)鍵的。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不加夾帶劑的情況下，幾乎沒有二苯乙烯苷被提取出來。以95％乙醇為夾帶劑，易于回收，不存在溶劑殘留的問題。在萃取過程中，以副泵的調(diào)頻來控制夾帶劑的泵入速度和用量。超臨界CO2萃取后，原料的性狀、結(jié)構(gòu)、形態(tài)幾乎沒有任何改變，可以繼續(xù)提取超臨界不適合的組分，為中藥資源的合理開發(fā)利用提供了新方法。